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发布时间：2024-02-06 丨 浏览次数：

　　BOB生理情况下，虽有少量内毒素不断向肠外移位，经门静脉进人肝内，但并不引起内毒素血症；在轻度革兰阴性杆菌感染时，虽然细菌不断向组织或血液中释放内毒素，但并不引起强烈的炎症反应，以上情况均有赖于机体内存在有效的内毒素清除与解毒机制。肝脏是清除内毒素的主要器官﹐脾﹑肠也是清除内毒素的重要器官；机体内的脂蛋白、阳离子抗菌肽（cationic antimicrobial peptides，CAP）、酰氧酰基水解酶（acyloxyacyl hydro-lase，AOAH）以及抗内毒素抗体是重要的内毒素解毒物质。肝脏对血液中的内毒素的清除功能，主要是通过库普弗细胞、肝细胞对内毒素的内吞作用而实现的，但具体代谢过程并不完全清楚。介导库普弗细胞吞噬内毒素的可能是清道夫受体，也可能是分子量11.9万和8.3万的蛋白质；介导肝细胞吞噬内毒素的结构可能是其凝集素样受体。内毒素与肝细胞血窦面细胞膜上的受体1：1结合后，被肝细胞以内吞的方式摄入细胞内，以微管依赖的囊泡运输方式，穿过肝细胞，运至肝细胞胆小管面，以胞吐方式排入胆小管中，再经胆道系统排至肠腔内。

　　一、巨噬细胞巨噬细胞除了能够在细胞表面表达CD14、TLRs以及清道夫受体等内毒素相关受体外，胞浆内也能表达蛋白质Nod1。CD14、TLRs是介导内毒素激活巨噬细胞的重要受体；清道夫受体与巨噬细胞清除、灭活内毒素有关；Nod1是胞浆内识别内毒素的分子。二、库普弗细胞库普弗细胞是肝脏吞噬、清除内毒素的主要细胞。在生理条件下，虽然仍有少量细菌及内毒素经门静脉进入肝内，但库普弗细胞都将之清除。库普弗细胞是肝内定居的巨噬细胞，是数量最多的定居组织内的巨噬细胞。理论上推测，如果库普弗细胞和其他巨噬细胞一样对内毒素十分敏感，细胞将会处于持续活化状态，但事实上库普弗细胞吞噬、清除内毒素时，其本身并未被内毒素所活化。说明在处理内毒素时，库普弗细胞与其他巨噬细胞有着不同的机制：库普弗细胞处理内毒素主要依靠其吞噬作用。在无血清存在时，库普弗细胞吞噬内毒素的作用也能正常发挥；而且随着内毒素浓度的适当增加，库普弗细胞的吞噬活性增强，该效应与分子量分别为11.8万和8.3万的两种蛋白质酪氨酸残基磷酸化事件有关。CD14是介导内毒素激活库普弗细胞的主要受体，清道夫受体是库普弗细胞重要的防御性受体，介导库普弗细胞清除和灭活内毒素。库普弗细胞激活共分四个阶段，其中CD14是细胞活化及功能变化的特征性标志。①静止期：表现为库普弗细胞数量少，形态小，多位于肝窦内，CD14染色多为阴性；②反应期：表现为局部库普弗细胞刺激性增生及全身单核-巨噬细胞肝内聚集﹔③预激期：即库普弗细胞表型发生转化期，表现为CD14等细胞膜受体出现，库普弗细胞功能发生改变；④激活期；表现为核转录因子NF-κB活化，细胞分泌各种细胞因子。通常库普弗细胞表达CD14水平较低、CD14阳性细胞仅占3.3%，而且CD14散在表达于这些细胞表面；与此相反，库普弗细胞普遍表达清道夫受体，且细胞表面清道夫受体呈弥漫性分布。有趣的是，随着内毒素浓度的不断提高，表达CD14的库普弗细胞明显增多，甚至高达96.1%。且细胞表面CD14表达呈弥漫性分布；与之相反，清道夫受体表达则明显下调，且与CD14表达上调呈显著负相关。与此同时，血浆ALT、总胆红素和肝组织内丙二醛水平均明显升高，以上三指标的变化与CD14表达水平呈显著正相关，而与清道夫受体表达水平呈显著负相关，说明随着内毒素水平的提高，库普弗细胞防御功能减弱，而引起肝功能损害的致炎作用增强，提示库普弗细胞由防御性细胞逐步转化为效应性细胞，而CD14表达上调、清道夫受体表达下调则是库普弗细胞功能转变的重要机制BOB。三、中性粒细胞中性粒细胞表面能够表达膜CD14（membrane-bound CD14，mCD14）和TLR4，内毒素通过与该类受体结合而激活中性粒细胞。中性粒细胞表面除了表达高亲和力内毒素受体CD14外，还表达低亲和力内毒素受体L-选择素，并经过该受体介导细胞活化。此外，整合素CD11b/CD18也被认为是中性粒细胞表面的一种低亲和力内毒素受体。在低浓度内毒素刺激时，由mCD14介导中性粒细胞活化；而高浓度内毒素刺激时，则由低亲和力内毒素受体介导中性粒细胞活化。游离内毒素激活中性粒细胞及与中性粒细胞结合均由CD14介导；而与红细胞等颗粒结合的内毒素，激活中性粒细胞由CD14介导，但后续的与中性粒细胞结合则由cD11b/CD18介导；完整的革兰阴性杆菌表面的内毒素与中性粒细胞结合，既非由CD14介导，也非由CD11b/CD18介导。四、内皮细胞一般认为，内皮细胞表面无mCD14表达，血清中的可溶性CD14（soluble CD14，sCD14）是介导内皮细胞识别内毒素的分子，同时TLR4参与内毒素诱导的内皮细胞激活。内毒素结合蛋白（Lipopolysaccharide—binding protein，LBP）将内毒素转运给sCD14，LPS/ sCD14复合物与内皮细胞膜上的TLR4结合并激活内皮细胞。sCD14除了能够介导内皮细胞活化外，还能介导内皮细胞清除内毒素，LPS/ sCD14/LBP形成三聚体并结合至内皮细胞上，继之LPS/sCD14发生内源化，从而将内毒素清除。最近，Jersmann等研究发现，内皮细胞表面也有mCD14表达，但其含量仅约为单核细胞表面的1/20。在无血清（无sCD14）存在的情况下，mCD14能够介导内毒素所致的内皮细胞活化，而且该过程是mCD14依赖性的；在此基础上加入血清，能使内皮细胞对内毒素的应答增强。先前已有研究发现，sCD14能够快速，高效地将内毒素转运给巨噬细胞、中性粒细胞表面的mCD14，从而使巨噬细胞、中性粒细胞对内毒素的应答增强。根据以上结果，Jersmann等认为，在内毒素激活内皮细胞的过程中，mCD14是必不可少的，sCD14在该过程只是起着将内毒素加速转运给mCD14的作用。五、肠黏膜上皮细胞肠黏膜上皮细胞始终与细菌及其产物发生持续性接触，这些细菌及其产物能够刺激其他类型的细胞并诱发炎症反应，但并不诱导肠上皮细胞产生防御反应，这一特点对于结肠上皮细胞来说显得尤为重要，因为如果结肠上皮细胞能够对肠道正常菌群产生反应，则会对机体造成不良影响。但是这并不意味着肠上皮细胞是免疫缺陷细胞，当遭受致病菌及其产物侵袭时，肠上皮细胞能够产生正常的应答反应，说明：①肠上皮细胞具有天然区分正常菌群和致病菌的能力，这与其识别系统的亚细胞定位有关。一些病原体识别分子定位于胞浆内（如Nod1）或基底侧细胞膜（如TLR5），只有当病原体及其内毒素、鞭毛蛋白等成分进人细胞内或到达细胞基底侧时，才能被识别并导致细胞活化；正常菌群不但不引起肠上皮细胞活化，反面能够通过与上皮细胞相互作用，抑制IκB降解，从面阻止NF-κB活化，表现出抗炎效应。②肠上皮细胞存在着与髓系细胞不同的内毒素识别机制。在正常人肠组织活检标本中，TLR2、TLR4的表达水平几乎测不出来；Caco-2、T84及HT29等肠上皮细胞系虽有TLR4表达，但无CD14及共受体MD-2表达，这也很好地解释了肠上皮细胞为什么对正常细菌及其产物无反应性。但也有研究发现，即使无CD14表达，TLR4表达阳性的肠上皮细胞也能识别内毒素并对之做出反应，前提是必须有别的细菌毒力因子存在。尿路致病性大肠杆菌（uropathogenic Escherichia Coli）的Ⅰ型菌毛是该菌的毒力因子之一，单独作用可引起肠上皮细胞产生细胞因子，此外Ⅰ型菌毛还能将内毒素呈递给肠上皮细胞，诱导肠上皮细胞释放细胞因子，该效应的实现有赖于肠细胞膜上TLR4的表达。

　　肠道黏膜免疫学屏障是防御肠道病原体和内毒素入侵的重要防线，slgA在肠道黏膜免疫中发挥重要作用。sIgA是保护肠黏膜的一个重要成分，既能阻止肠腔内细菌在黏膜表面定植，也能中和内毒素。有研究发现，在肠黏膜遭受O157大肠杆菌感染时，抗内毒素核心多糖的特异性slgA分泌增加，在恢复期病人表现得尤为明显，提示slgA对防止内毒素向机体内转移具有保护性作用。另外，有研究提示NO在肠黏膜局部形成的氧化屏障具有防止内毒素移位的作用。生理条件下，iNOS仅在呼吸上皮，妊娠子宫及回肠黏膜等少数部位表达。但在内毒素的诱导下，正常的结肠上皮细胞也表达 iNoS并催化合成NO，在局部形成氧化屏障，从而防止结肠细菌移位，因此有效地防止细菌的移位，也间接防止了内毒素的移位。

　　在机体防御系统中，对肠道内毒素移位起抑制作用的成分包括肠黏膜机械屏障、肠黏膜免疫屏障、肠道正常菌群以及肝脏的肝细胞和库普弗细胞，其中肠黏膜机械屏障，肠黏膜免疫屏障、肝细胞和库普弗细胞起着直接抑制作用，而正常菌群则起着间接抑制作用。肠道是巨大的“内毒素库”，特殊的解剖部位决定了肠黏膜必须是一道有效的防御屏障。肠黏膜屏障由黏膜上皮细胞形成的机械屏障和分泌型IgA（sIgA）等形成的免疫学屏障组成。生理条件下，肠上皮细胞一般不吸收肠腔内的内毒素。有实验证明，经静脉注入的内毒素可以出现在肠上皮细胞中，但向肠道内灌注的内毒素只在肠腔内靠近肠黏膜的部位聚集，而不进入上皮细胞内。肠上皮细胞及细胞间紧密连接形成的黏膜机械屏障，是防御肠腔内毒素移位的一道重要屏障，保持完整性是其发挥防御作用的重要保证。严重创伤﹑烧伤时，体液大量丢失，血容量不足，导致机体缺血缺氧。为维持血压、保证心脑等重要器官的血液供应，内脏血管代偿性收缩，其中胃肠缺血缺氧时间较其他器官更长，即使休克病人经液体复苏血流动力学恢复正常后，胃肠道仍处于隐匿性休克状态。因此，当肠璧微血管恢复灌流时，肠发生缺血/再灌注损伤，上皮细胞产生大量的活性氧等介质，导致肠上皮细胞凋亡、细胞间紧密连接破坏，肠黏膜通透性因而迅速增加，机械屏障功能削弱，从而促使肠腔内的内毒素经肠璧吸收并向肠外组织移位。活性氧是导致肠黏膜损伤的最重要因素。进入血中的内毒素可以引起血管内凝血、微血管通透性增加及血压下降等病理生理变化，从而导致全身多个器官发生缺血缺氧性损害，而胃肠道又是最先受损的靶器官之一，在此情况下，肠上皮细胞及肠固有层巨噬细胞内的诱生型一氧化氮合酶（induciblenitric oxide synthase，iNOS），黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）活化，一氧化氮（NO），氧自由基大量产生、NO与超氧阴离子结合生成强氧化剂过氧化亚硝酸盐。过氧化亚硝酸盐及超氧阴离子，是介导内毒素血症诱发肠损伤的主要介质，它们通过作用于脂质﹑蛋白质及DNA，导致脂质过氧化、酶失活﹑蛋白质功能抑制以及DNA损伤，从而导致肠上皮细胞、固有层微血管内皮细胞损伤甚至凋亡；大量产生的NO也可能直接诱导肠上皮细胞凋亡；另外局部浸润的白细胞能够释放氧自由基等活性物质，也参与肠组织的损害。肠黏膜营养不良也是促进肠黏膜损伤的重要因素之一。首先，肠上皮细胞对营养物质的需求量较大。肠上皮细胞具有增殖周期短、生长旺盛等特点，因而具有较强的自我修复能力，对营养物质的需求量也较大。其次，肠上皮细胞对营养物质的需求具有自身特殊性，即需要营养物质和肠黏膜直接接触。直接接触不仅可以提供肠上皮增殖所需的营养物质，而且还能促进局部生长因子的分泌，尤其是肠三叶因子的分泌。肠三叶因子由肠绒毛杯状细胞所分泌，对肠道具有特殊保护作用。在严重创伤、烧伤情况下，虽然已建立静脉营养途径，可为全身提供足够的营养成分，但肠黏膜营养物质仍然缺乏，因此肠黏膜的损伤仍然严重，反映黏膜完整性受损的指标——血浆二胺氧化酶活性明显升高、肠黏膜跨膜电位差显著降低，与此同时，反映黏膜细胞增殖能力的增殖细胞核抗原值明显降低，说明肠上皮细胞增殖﹑移动速度减慢，这就使得受损的肠黏膜不能及时修复。

　　一、内毒素的释放革兰阴性杆菌菌体自溶或被裂解时释放内毒素，但这并非是细菌释放内毒素的惟一途径。在革兰阴性杆菌生长繁殖过程中，内毒素也不断从细胞壁上脱落下来并释放到周围的介质中去。即使在营养物质贫乏的生理盐水中，细菌也能生长，加之内毒素性质比较稳定，如100℃时1h尚不能被破坏，必须加热至160℃经2～4h，或用强酸、强碱或强氧化剂加温煮沸30min才能灭活﹐因此，内毒素几乎无处不在。二、内毒素的移位肠道中寄存着数目庞大，种类繁多的细菌，其中的大肠杆菌等革兰阴性杆菌不断向肠腔中释放内毒素。因此，肠腔不仅是“储菌所”，也是“内毒素库”，肠腔中的内毒素含量足以导致宿主死亡，但由于肠粘膜具有良好的屏障功能，故生理情况下仅有少量内毒素向肠外移位，而且这些内毒素很快被肝脏所破坏。但是，当化疗、休克引起的缺血缺氧、严重创伤、烧伤时的应激等因素导致肠黏膜屏障功能受损时，内毒素向周围组织器官中或血液中移位，其移位途径包括：①经门静脉、肝脏进入体循环；②经肠道淋巴管进入淋巴系统；③穿过肠壁进入腹膜腔进而吸收入血。肠道细菌、呼吸道细菌等产生的内毒素引起的内毒素血症，称为内源性内毒素血症；创面感染灶或体内感染灶的内毒素也可以向血液中移位，来自于感染灶的内毒素﹑输注的液体中污染的内毒素等引起的内毒素血症，称为外源性内毒素血症。

　　在人类赖以生存的自然环境中，生活着数以万计的微生物，它们不断地与人体发生接触，或黏附于皮肤表面，或被摄入消化道、吸入呼吸道，有的甚至穿越皮肤、黏膜屏障而侵入机体，与此同时，病原体的某些特定的保守结构向机体发出感染危险信号，从而激活机体防御系统产生防御应答，限制病原体扩散，清除、杀灭病原体；清除、中和病原体释放的产物。革兰阴性杆菌感染时，作为感染危险信号的内毒素，同时也是最主要的机体防御应答诱导剂。机体防御系统主要由天然免疫系统和获得性免疫系统组成。天然免疫系统包括皮肤、黏膜的机械屏障及其表面的正常菌群、杀菌和（或）中和毒素的物质、补体等体液成分、单核一吞噬细胞系统等。天然免疫系统对细菌及其产物的识别和应答是非特异性的，因而能够对入侵的病原体立即做出应答，从而构成机体防御系统中的第一道防线。获得性免疫系统由抗体介导的体液免疫及T细胞介导的细胞免疫构成。获得性免疫系统对病原体及其产物的应答是特异性的，即只对特异性抗原作出特异性免疫应答，而且只有在受到特异性抗原刺激或诱导后，获得性免疫系统才能够建立。尽管健康人体已经具有了完善的获得性免疫系统，但对病原体及其产物的识别仍有赖于古老的天然免疫系统。巨噬细胞、树突状细胞等天然免疫细胞识别病原体特定成分，并将病原体摄入细胞内加以杀灭，将病原体降解后形成的特异性抗原提呈给抗原特异性T细胞，从而形成激活抗原特异性T细胞的第一刺激信号；天然免疫细胞受内毒素等病原体特定成分刺激后，能够分泌细胞因子并在细胞表面表达共刺激分子，从而形成激活抗原特异性T细胞的第二刺激信号，促使T细胞活化，产生特异性细胞免疫。特异性免疫反过来又可以加强天然免疫系统，从而有效地抵抗病原体感染。内毒素在机体内的代谢过程主要包括：内毒素的释放和移位、内毒素的清除和解毒。机体防御系统对内毒素产生应答时，起主要作用的是天然免疫系统，它几乎参与了内毒素在机体内代谢的整个过程：肠道黏膜屏障能够抑制肠道内毒素移位；清道夫受体（scavenger receptors，SR）等介导吞噬细胞识别、吞噬、清除内毒素；肝脏库普弗细胞（Kupffer cell，KC）清除内毒素；杀菌性/通透性增加蛋白（bactericidal/ permeability in-creasing protein，BPI）等中和内毒素。

　　一、内毒素分子的跨膜转运LPS分子合成后从周质间隙转运至外膜的机制不清。与磷脂的跨膜转运不同，LPS的跨细胞外膜转运是不可逆的。ABC转运装置中的MsbA可能参与LPS分子的跨膜转运，该过程需要ATP参与。Muhlradt等提出LPS分子可能通过内、外膜黏附点处的“Bayer桥”（Bayers bridges）实现跨膜转运，因为新合成的LPS分子都位于此处的细胞外膜的外叶，通过外叶中LPS分子的横向运动，这些胞膜皱缩呈散在分布。每个细胞大约有50处这种内外膜间的黏附点。二、O-特异多糖链合成的遗传学研究与O-抗原合成有关的基因分三类（表3-2）：①NDP-单糖合成有关的基因，此类基因的命名按其参与合成的糖命名，如与CDP-阿比糖合成有关的基因命名为abe；②NDP单糖转移有关的基因，其命名为wb-，它的产物为糖基转移酶，负责О-抗原重复单位合成中的糖基转移；③多糖链加工有关的基因，命名为wz-，如参与O-抗原链长度调节的基因命名为wZz。综上所述，LPS的生物合成是在细胞膜的胞浆面独立合成core-Lipid A和О-抗原，二者在周质间隙面连接形成完整的LPS分子，经跨膜转运分布于细胞表面。由于LPS分子的多样性，迄今仍有许多尚未阐明。如短波单胞菌Lipid A的分子具有一个2，3-二氨基-2，3-双脱氧-D-葡萄糖（DAG）二糖而不是葡萄糖胺二糖结构；而空肠弯曲菌则含有一个由DAG和葡萄糖胺组成的杂二糖结构等，因此完整揭示内毒素的分子结构，尚需进一步的研究工作积累。

　　从Lipid ⅣA开始，核心多糖的合成是在非还原性葡萄糖胺的C-6m´上引入KDO（核心寡聚糖）后，逐步加人庚糖和己糖。合成完整内核的酶在大肠杆菌中是由waa（rfa）基因编码，调控机制目前仍不清楚。一、KDO的合成与附着KDO的合成包括三个连续反应（如下图）：其中8-磷酸-KDO合成酶是由kdsA基因编码的。KDO的附着是在CMP-KDO合成酶（CKS）（ kdsB基因编码）催化下，KDO与CTP反应生成CMP-KDO活化形式，非活化的KDO是无法直接与 Lipid ⅣA结合的。CMP-KDO在KDO转移酶的催化下，将KDO结合至Lipid ⅣA的C-6´位上，然后再在同样的转移酶的作用下将第2个KDO分子加至第1个KDO分子上。二、庚糖和己糖的加入在细胞膜的胞浆面，庚糖和己糖分别以ADP和UDP结合的活化形式，在一系列膜相关的糖基转移酶催化下，被逐一加人到KDO分子上。这些膜相关的糖基转移酶可能存在于细胞膜的胞浆面，缺乏跨膜区，其大小和结构相似。有关单糖的转运装置，目前尚不清楚。因此合成的core-Lipid A分子可能是在ABC转运装置（ATP-binding cas-sette（ABC）- transporter）的参与下从细胞膜的胞浆面转移到周质间隙面，在周质间隙内进一步完成与O-抗原多糖链的连接反应，从而生成完整的LPS分子（图3-3）。核心多糖的合成过程如图3-4所示。在核心多糖的合成过程中，ADP-Hep是内核合成的重要环节。在大肠杆菌中ADP-Hep的合成需要三种蛋白质参与，它们是GmhA（景天庚酮糖-7-磷酸异构酶）、HldE（双功能D-3-D-甘露庚糖7-磷酸激酶或DβD-庚糖1-磷酸腺核苷酰基转移酶）和GmhB（D，D-庚糖1，7双磷酸酶）蛋白，此外还有ATP和7-磷酸景天庚酮糖。ADP-Hep的合成受waaD（rfaD）基因调控。三、core-Lipid A的跨膜转运在core-Lipid A合成后，转运至细胞膜的周质间隙面，在此完成与O-抗原的连接，形成完整的LPS分子。目.前，关于core-Lipid A跨膜转运的具体机制仍不清楚，可能与msbA基因有关。msbA基因是大肠杆菌内的一种重要的基因，它与哺乳动物的mdr蛋白和某些细菌编码ABC转运装置的基因具有高度的同源性，而mdr2（哺乳动物细胞中的一种ABC转运装置）参与了卵磷脂的跨膜转运，这提示msbA有可能也参与了core-Lipid A的跨膜转运。大肠杆菌的msbA基因作为htrB突变体的抑制物已经得到证实。htrB基因编码十二烷酰转移酶，它在KDO附着于Lipid ⅣA后才起作用，能将十二烷酰链从酰基载体蛋白转移至KDO-Lipid ⅣA上，研究表明，在高温环境下（42℃ 3h），msbA基因编码的MsbA蛋白可能作用于core-Lipid A 的跨膜转运过程，因为它可以明显减少htrB基因突变体所形成的四脂酰化的core-Lipid ⅣA在细胞膜胞浆面的聚集。与五脂酰化或六脂酰化的core-Lipid A相比，MsbA蛋白对四脂酰化的core-Lipid ⅣA的转运效率是有所区别。Raetz等通过热敏的msbA突变株在不够条件的温度下导致充分酰化的core-Lipid A在胞浆面的聚集，证实了其跨膜转运功能。Msb A蛋白作为ABC转运装置家族成员之一在core-Lipid A的跨膜（细胞膜）转运及合成过程中起重要作用，并且它也可能参与磷脂的跨膜转运。参与核心多糖合成过程中的糖基转移酶或修饰酶是由一类介于cysE和 pyrE基因之间的wa-基因编码（如表3-1），分布在三个操纵子中。例如对于大肠杆菌R1的核心结构而言，其生物合成是在一系列 waa-基因的调控下进行的（图3-5）。 图3-5中A部分表示大肠杆菌R1核心多糖的己糖和庚糖的糖基化转移、修饰和磷酸化过程的 waa基因调控；B部分表示参与核心区合成的各个基因分布位点，另外指出waaF基因位于waaC基因的上游（与大肠杆菌K-12和鼠伤寒沙门菌相同）。

　　O抗原的合成发生在细胞膜的胞浆面，以膜结合脂（GCL）与 NDP-单糖结合为起始点，至新生O抗原在周质间隙面与core-LipidA连接成LPS为终止点。GCL又名脂质抗原载体（ antigen-carrie lipid，ACL），是一种十一异戊二烯醇（undecaprenola或prenol）单磷酸﹐它在细胞内合成并可进一步磷酸化。在细胞膜上，GCL、P-GCL和 PP-GCL间的磷酸化和去磷酸化维持一定的动态平衡，在О抗原的合成过程中发挥重要作用。О-抗原合成途径分为两种下面介绍其中一种：O-抗原多聚化酶（Wzy）依赖型此途径的第一步是在GCL上进行寡聚糖重复单位的合成，其主要特征是寡聚糖重复单位在胞浆面以GCL-PP形式合成，然后在О-抗原易位酶（Wzx）参与下转移至周质间隙面以进行重复单位的多聚化反应，多糖链向还原末端延伸，在非常接近膜的部位发生聚合，该反应需要Wzy催化。Wzy的调控基因若发生缺失，则只能形成结合一个重复单位的LPS（半粗糙型）。通过此途径合成的O-抗原均为异聚体（即重复单位由不同的糖基构成）。1、O-抗原重复单位的合成该步反应发生在细胞膜的胞浆面（图3-6）。如沙门菌属的三糖基本骨架，在磷酸化酶的作用下UDP-Gal与GCL-P反应形成GCL-PP-Gal和UMP。在通过两次糖基化反应是不同的NDP-单糖转移到Gal-PP-GCL上，形成三糖基本骨架。沙门菌О-抗原的三糖骨架重复单位的合成如下图：2、O-抗原多糖链的聚合GCL-PP-Gal在一系列糖基转移酶的催化下完成重复单位的合成。新合成的GCL-PP-重复单位作为一个整体从胞浆面转移至周质间隙面，此转运过程可能是在Wzx参与下完成的，Wzx是一种具有12个跨膜区域的疏水性蛋白质。在Wzy催化下，己经聚合的重复单位链被转位到新合成的GCI-PP-重复单位上（图3-6），因此多糖链的延长是在其还原端开始的BOB。沙门菌О抗原多糖的聚合反应可以用下式表示：重复单位的聚合发生在细胞膜的周质间隙面（图3-3，图3-6）。已转位出多聚体的PP-GCL在进行下一次重复单位合成前，须经过焦磷酸酶作用形成P-GCL才能再次进入循环。3、聚合后的修饰沙门菌О-多糖重复单位的取代可表现出异质性，主要表现在O-抗原重复单位上单糖和（或）O-乙酰基取代基团的有无。例如鼠伤寒沙门菌О-特异多糖的半乳糖4位上被葡萄糖取代，从而形成О-抗原因子122，即在半乳糖上连接有以α-1，4键相联的葡萄糖。这是所谓的O-抗原修饰的典型例子。该反应需要一个葡萄糖脂中间物质的参与，这一物质己经被确定为β-Glc-P-GCL。4、多糖的转位在连接酶Waal的作用下，О抗原在细胞膜的周质间隙面与core-Iipid A连接，形成完整的LPS分子。Waal是目前己知的惟一与连接反应有关的酶﹐能有效地把高分子量多聚体或低分子量寡聚体连接起来。Waal可同时识别О-抗原和core-Lipid A中的核心结构，目前对该连接酶的认识还较少。大肠杆菌K-12的某些О-抗原重复单位与核心多糖相连的糖基为N-乙酰葡萄糖胺而非半乳糖。这类重复单位的合成是由对衣霉素敏感的UDP-GlcNAc：GCL-P-GlcNAc-1-P转移酶（WecA）催化起始反应的（图3-6），后续的重复单位合成和多聚化反应与沙门菌的相同。

　　Lipid A的生物合成发生在细胞膜的胞浆面。既往认为Lipid A的合成起点为UDP-N-葡萄糖胺（UDP-GlcN），目前已证实真正的合成起点为UDP-N-乙酰葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）。Lipid A的合成是在lpx基因簇编码的一系列酶的催化下，经过UDP-N-乙酰葡萄糖胺、UDP-单脂酰乙酰葡萄糖胺、UDP-2，3二脂酰葡萄糖胺、Lipid Ⅹ、LipidⅣA等一系列中间体的合成步骤，最终生成Lipid A。其中β-羟基14烷酸-酰基载体蛋白[（β-OH）C14-ACP]在Lipid A的生物合成中提供Lipid A结构中的β-羟基14烷酸﹐酰基载体蛋白（acyl carrier protein，ACP）由acpP基因编码。一、UDP-单脂酰乙酰葡萄糖胺在UDP-N-乙酰葡萄糖胺酰基转移酶（UDP-GlcNAc O-acyltransferase）（lpxA基因编码）的作用下，UDP-GlcNAc在3-羟基位被（β-OH）C14-ACP提供的β-羟基14烷酸酰化生成UDP-单脂酰乙酰葡萄糖胺（UDP-3-monouoyl-GlcNAc）（图3-1）。二、UDP-2，3二脂酰葡萄糖胺和Lipid ⅩUDP-3-monouoyl-GlcNAc在N-脱乙酰酶（UDP-3-O-N-acetylgluco samine deacety-lase）（lpxC基因编码）作用下脱去C-2氨基上的乙酰基团，然后在酰基转移酶（acyl-transferase）（lpxD基因编码）的催化下向C-2氨基转入ACP结合的β-羟基14烷酸，生成UDP-2，3-二脂酰葡萄糖胺（UDP-2，3-Di-acyl-GlcN）（图3-1）。最后在焦磷酸酶的作用下，磷酸置换出UDP，生成1-磷酸-2，3-二脂酰葡萄糖胺即 Lipid X（图3-2）。三、Lipid Ⅳ A在Lipid A 双糖合成酶（disaccharidesynthase）（lpxB基因编码）的催化下，UDP-2，3-二脂酰葡萄糖胺和 Lipid X在1-6位置通过焦磷酸键连接缩合生成Lipid A前体分子二糖1-磷酸（二糖1-P）。此时每个糖基上有2个β-羟基14烷酸，还原性葡萄糖胺的C-1位上有一磷酸基。然后在C-4-膜结合激酶（membrane bound 4 kinase）的作用下（在大肠杆菌中由lpxK基因编码），非还原性葡萄糖胺的C-4上再连接一个磷酸基团，生成1，4-二磷酸四脂酰葡萄糖胺双糖即LipidⅣA（图3-2）。四、Lipid ALipid ⅣA在转变为Lipid A 的合成反应中，在KDO转移酶（KDO transferase）（kdtA/ waaA基因编码）的作用下，非还原性葡萄糖胺的C-6´与CMP-KDO中的KDO偶联。然后在同样的转移酶作用下使第2个CMP-KDO与第一个KDO的C-4-OH结合。Lipid A中的脂肪酸（十二烷酰和十四烷酰链）是在KDO结合到Lipid ⅣA后，再通过一种独特的酰基转移酶（acyltransferases）（htrB和msbB基因编码），在Lipid ⅣA的C-2´和C-3´位脂肪酸主链上再引入2个饱和脂肪酸（C12，C14），从而在胞浆面形成较为完整的疏水性的锚状结构即KDO-Lipid A（图3-3）。在第4步的合成中，不同细菌所连接脂肪酸链的程度可以不同，这是造成不同细菌的LPS毒力差异的原因之一，这与某些基因的调控有关，如沙门菌的PhoP/PhoQ因子，它可调控Lipid A中2-羟基十四烷酸盐和棕榈酸盐的修饰，从而增强了细菌对宿主非特异性免疫识别的逃逸能力。沙门菌逃避宿主杀灭的机制﹐主要受控于PhoP/PhoQ双成分调节因子。PhoP/PhoQ通过磷酸化或结合特定的启动子，诱导或抑制基因的表达，这些基因称为phoP激活基因（pag）和phoP抑制基因（prg）。通过这些基因的调控表达，可使沙门菌适应外周的环境，抵抗宿主细胞的杀灭作用。pag基因和prg基因的平衡表达是维持沙门菌生存所必需的。目前发现pagC、pagD、pagJ 、pagK、pagM和pagP与沙门菌的毒力有密切关系。参与Lipid A合成的酶都位于细胞质或细胞膜的胞浆面，因为在体外研究中发现，从Lipid ⅣA转变成Lipid A的过程中都需要去垢剂的激活。但近年在鼠伤寒沙门菌中发现，由pagL基因（PhoP/PhoQ-activatedgene L）编码的一种独特的脱酰酶以及在大肠杆菌中由pWLP21质粒控制合成的蛋白质，可以 PhoP/PhoQ依赖的方式导致Lipid A的R-3-羟基十四烷酸发生改变，从而造成Lipid A对阳离子抗菌肽的耐受性加强，但它不影响细菌细胞的生长。通过分离外膜和SDS/PAGE分析，该脱酰酶主要位于细胞外膜，由185个氨基酸序列组成，其氨基端是20个氨基酸组成的信号肽。在这个过程中，有可能lpxO基因也参与其中，它可能编码产生一种Fe2+/α酮戊二酸盐依赖的双加氧酶，催化Lipid A或其前体的羟基化，该酶是一种含有302个氨基酸的蛋白质，位于细胞膜上，其两端具有与膜结合的锚状结构；另一个位于外膜的酶由pagP基因所编码，其作用和pagL相似，参与2-羟基十四烷酸盐的修饰。尽管Lipid A的结构相当保守，但在许多生物体中，已证实Lipid A仍存在进一步的共价修饰，这种修饰可能与细菌的致病性或有利于其在宿主体内的生存有关。一种位于细胞膜胞质面的4-氨基-4-脱氧阿拉伯糖（4-amino-4-deoxy-1-arabinose，1-Ara4N）转移酶（ArnT）可以在Lipid A合成的过程中，将1或2个1-Ara4N转移至Lipid A或其前体分子Lipid Ⅳ A的磷酸基团上，从而导致大肠杆菌K-12和鼠伤寒沙门菌对多粘菌素的耐受。在鼠伤寒沙门菌中，该酶由染色体上的orf5，pmrK和yfbl基因编码，含有548个氨基酸残基并可能存在12个跨膜区域，在绿脓假单胞菌和耶尔森菌也被发现有类似的氨基酸序列。

　　从20世纪30年代至今，根据内毒素的理化性质而设计的分离、鉴定内毒素的技术方法主要有下述几种：一BOB、分离提取（一）三氯醋酸法 Boivin和Messrobeanu于1935年，将活菌或经冷冻干燥的大肠杆菌，在4℃条件下与0.25N的三氯醋酸共同振荡或剧烈搅拌，将细菌细胞裂解，使LPS分子从破溃的细胞外膜上游离出来。离心后取上清液经浓缩后，加2倍体积的冷冻乙醇，将生成的沉淀物溶解、浓缩后冷冻干燥，即得到LPS干粉。此法提取的LPS含有10%左右的菌体蛋白，这些蛋白质可影响LPS的理化性质和生物学活性。（二）酚-水法 wesphal和luederitz于1952年为分离含蛋白质较低的LPS而建立的方法，以后被广泛应用于水溶性S-LPS的提取。具体过程为：在细菌的水溶液中，加入等量90%的酚将细胞裂解，使内毒素分子从破溃的细胞外膜上游离出来。68℃，振荡10～15min后，冷却、离心，收集富含LPS的水相，并反复用水萃取3～5次，然后将水相浓缩、冷冻于燥，得到粗提的LPS，将粗制品溶解于水，高速离心（100000g，2～3h），得到颗粒状LPS后再溶于水中冷冻干燥。此法提取的LPS纯度较高，蛋白质含量为1%~3%。（三）酚-氯仿-石油醚法 由Galanos设计的提取R-LPS的方法。预先经乙醇、丙酮、脱脂后的干燥菌，用90%苯酚﹑氯仿及石油醚按2∶5∶8所组成的混合提取液提取2～3次，取酚相，得到LPS和孔蛋白（porin）提取液，用减压法去除溶媒，加水形成沉淀，并洗涤3～5次，然后再用80%苯酚复溶，减压干燥，得到的LPS粗制品溶于水，超速离心取沉淀，即得到LPS纯品。此法纯化得到的LPS，不含核酸和多聚糖，蛋白质含量可控制在1%以下。（四）水-丁醇法 由Morrison等于1975年设计。水-丁醇法较酚法简便，温和，适用于提取大肠杆菌和沙门菌的LPS；所得制品含蛋白量约1%。但此方法仍存在一些不足，由于丁醇不能灭活制品中酶类，导致在制备过程和储存时，Lipid A常发生降解。二、纯化 （一）离子交换层析法利用阳离子树脂非特异性的吸附带负电荷LPS的性质，将LPS从流动相中分离纯化出来。（二）亲和层析法 利用多粘菌素B特异性结合LPS的特性，将多粘菌素B包被于聚丙烯胺树脂等高分子聚合物的表面，制成特异性结合LPS的层析柱，即可对LPS进行亲和层析法纯化。（三）金属离子和小分子量多胺成分的去除 通常情况下，未提纯的LPS溶液中存在大量的小分子带电物质，如Mg2+ 、Ca2+和少量的Fe2+ 、A13+、Zn2+、Na+等离子及乙醇胺、腐胺﹑精胺、亚精胺及尸胺等小分子量多胺。它们中和LPS分子上带负电荷的磷酸基团，使得本可以用带电荷的吸附剂将LPS除去的效果明显降低。电透析便是通过离子交换的方法进行LPS纯化的。其原理就是将很多的阴/阳离子交换膜交错地串联在一起，电解质溶液则在膜间流动，两侧施加直流电之后溶液中阳离子（如无机阳离子、生物碱等）向阴极移动而阴离子（如无机阴离子、有机酸等）向阳极移动。其中阴离子可顺利通过阴离子膜，但再往前移动时却被邻近的阳离子膜挡住。同样，阳离子也可以顺利地通过阳离子膜而无法通过阴离子膜。中性化合物及高分子化合物则留在透析液中，最终得到纯化的提取物（图2-6）。由于提取的LPS中含有较多带正电荷的杂质，因此在LPS的电透析过程中可发现阴极的pH值升高，阳极的pH值变化不明显的现象。电透析过程中LPS溶液的pH值常有一定程度的下降，同时由于有稳定LPS多聚体功能的Mg2+ 、Ca2+等离子成分被除去，LPS多聚体变为单体而发生沉淀。为避免此现象，需用NaOH或三乙胺将其中和到pH 7.0左右，使其形成中性的、高水溶性的LPS钠盐和LPS三乙胺盐而重新溶解。电透析结束时，LPS一般为酸性产物，此酸性LPS在水中的溶解度极低，可直接进行冻干处理，-4～-20℃低温保存，每次使用前可用不同的碱中和转化成所需要的LPS盐。（四）核酸成分的去除 根据LPS与核酸片段在分子量上的差异，可用超速离心法、电泳法等方法将其去除。

　　（一）热稳定性LPS（lipopolysaccharide，脂多糖）中性溶液在室温放置数月，其生物学活性不发生明显的改变，在4℃或低温冰箱中，其生物学活性可保持数年至数十年。冷冻干燥的LPS中性粉剂，在室温或冰箱条件下可放置几十年或更长时间而不失去其生物学活性。细菌LPS具有很强的耐热性，一般的高压灭菌不能使其灭活，115℃ 30 min的湿热仅能破坏25%左右的内毒素活性。内毒素在50%相对湿度下可被环氧乙烷去除活性。当LPS的水溶液在不同温度下处理时，发现在200℃ 1h仍能检测出内毒素活性，而进一步加热到250℃ 30～45min，或180℃ 3~4h则活性完全消失。我国2000年版药典内毒素检查法规定，玻璃器皿的热原处理为250℃干烤1h以上。（二）酸碱稳定性室温条件下LPS在酸性溶液中可发生部分降解，这主要由核心多糖与Lipid A间糖苷键的裂解引起，在加热的条件下这一反应可加速。在0.1N醋酸中，100℃， 45min可使LPS失去90%的生物活性。在加热条件下﹐强酸溶液可使LPS分子彻底破坏。50%的枸橼酸（pH 1.0）可水解 Lipid A 的磷酸基团或羟基脂肪酸等活性基团。碱性因素主要导致Lipid A骨架上连接的磷酸酯键及脂肪酸酯键水解，使Lipid A 结构受到破坏，从而导致LPS分子失去活性。故LPS宜在中性﹑低温的条件下保存。（三）辐照对LPS的影响长时间（48h）、大剂量的Co60照射后，LPS的结构可以被完全破坏。如有条件，对不能用干烤处理的实验器具，可用长时间，大剂量的辐照清除LPS。（四）氧化剂对LPS活性的影响过氧化氢是一种强氧化剂，具有防腐、灭菌、除臭及清洁等作用。它分解后能释放大量新生态氧，可氧化分解LPS。过氧化氢主要裂解LPS中Lipid A还原端C1位的磷酸基团。产生的单磷酸LPS，使其毒性下降，实验证明，单磷酸的Lipid A毒性明显弱于野生型的Lipid A，这与过氧化氢降解LPS后毒性下降结果相符。用鲎试剂检测常用氧化消毒剂对大肠杆菌内毒素的灭活作用，结果显示，氯石灰溶液（含5000mg/L有效氯）在20℃作用30min、氯胺T溶液（含5000mg/L有效氯）在20℃作用70min可灭活95%以上的LPS活性。在60℃加热条件下，氯胺T灭活同量内毒素仅需40min，0.2%酸性高锰酸钾作用2min、1.0%中性高锰酸钾作用160min可灭活95%以上的LPS。

　　一、LPS的吸附特性LPS（lipopolysaccharide，脂多糖）在水溶液中的多聚体，由于亲水性的O-特异性多糖链位于多聚体的外侧，因此，极易与疏水性物质发生吸附作用，尤其是实验中的各种塑料、玻璃容器。石棉、活性炭、荷电膜（荷电微孔滤膜）等能够非特异性地吸附LPS。因此，在制药工业中，利用这种特性，可以去除药品及药品原料中的内毒素。二、LPS 盐的物理特性（一）水溶性电透析后直接得到的酸性LPS被各种碱中和后得到不同的LPS 盐。它们在水中的溶解度差异很大。R-LPS的三乙胺盐在水中的溶解度可达20mg/ml，形成一种透明、无黏度的溶液BOB。S-LPS的三乙胺盐溶解度可高达400mg/ml。迄今所知，LPS的三乙基乙胺或四乙基乙胺盐在水中的溶解度最大，LPS钾盐的溶解度稍高于钠盐而低于三乙胺盐，而LPS吡啶盐及铵盐的溶解度则低于LPS的钠盐，LPS的两价阳离子盐如钙、镁盐及有机盐的溶解度都极低，其中 LPS镁盐常常是不溶解的。（二）在缓冲液中的溶解度各种S-LPS盐在常用的生理性缓冲溶液中的溶解特性与它们在双蒸水中的溶解性相似，LPS的三乙胺盐溶解度最高，而LPS两价阳离子盐溶解度最低。而R-LPS 盐一般不溶于生理性缓冲溶液中。另外加入足够的两价阳离于可使R-LPS从溶液中完全沉淀下来。R-LPS钠盐比三乙胺盐更易被Ca2+及 Mg2+沉淀。LPS分子间形成不同程度的聚集体决定了各种盐类的不同溶解特性和特征性的沉淀系数（S）。

　　Lipid A是一种糖磷脂，它与一般磷脂分子在结构上有所差别：①一般的磷脂仅连结两个脂肪酸并且不具有双糖结构，而Lipid A在D氨基葡萄糖双糖骨架上连结多个脂肪酰残基；② Lipid A含饱和或3-羟基脂肪酸，后者中的羟基可被饱和脂肪酸进一步酰化形成3-脂酰基脂肪酸，这是Lipid A的特有成分；③Lipid A分子上的磷酸基团可携带大量的负电荷，使LPS可与阳离子发生强烈的相互作用，因而阳离子对LPS的物理特性和生物学功能发挥显著的影响。当用小牛血清白蛋白作为助溶剂时；白蛋白与Lipid A形成的Lipid A白蛋白复合物可完全溶于水，此复合物在真空干燥后仍可溶于水，这种溶解方法多年来被广泛地用于Lipid A生物活性的研究。Lipid A三乙胺或四乙胺盐的溶解度较高，一般可达10～50mg/ml，真空干燥不影响其溶解度。Lipid A 三乙胺盐的溶解度还取决于制备Lipid A时所用的水解方法。如果制备方法采用0.1mol/L HCl水解法，由于去除了Lipid A分子上酸敏感的1-磷酸，所形成的Lipid A即使经电透析转化成相应的三乙胺盐亦极难溶解，故磷酸基的存在对于Lipid A的溶解性是至关重要的。如果采用2mol/L HCl，由于HCl能与LPS中的阳离子快速且强烈地结合﹐在0℃的条件下作用几分钟后离心就可将Lipid A沉淀下来，用双蒸水多次洗涤，将上清液中的盐去除后得到酸性的LipidA，再用三乙胺中和滴定，得到水溶性较高的Lipid A 三乙胺盐。低浓度Lipid A钠盐具可溶性，但当浓度增加到1mg/ml时，Lipid A钠盐溶液的黏度就会显著增加。Lipid A的钙、镁、腐胺盐几乎完全不溶于水。由于LPS在强酸的条件下容易裂解成多糖和Lipid A，故强酸法不适合于LPS的去离子过程。Lipid A是一种两性分子，但双糖骨架的亲水性与脂肪酸的疏水性相比明显较弱。因此，Lipid A与亲水性的О-抗原及核心多糖分离后﹐游离的Lipid A水溶性降低，但可部分溶解于吡啶、三乙胺、二甲基亚矾等溶剂中。在溶解状态时，游离的Lipid A具有完整内毒素的大部分毒性作用。

　　Lipid A是一种分子量约为2000的磷脂，主要由氨基葡萄糖双糖构成的亲水性骨架和疏水性的长链脂肪酸两部分组成，其结构如图2-5所示。Lipid A是LPS中最为保守的部分、是LPS的毒性和生物活性中心，是LPS中最为保守的组成模式，无种属特异性。它位于LPS分子的最内侧，参与细菌外膜外叶的构成。 Lipid A双糖骨架由1个β-1，6-糖苷键相联的氨基葡萄糖双糖单位组成，通过X线衍射等方法已证明双糖单位在同一个平面上，且与外膜表面形成约45°的夹角。双糖骨架通过β（1，6）糖苷键连接，双糖骨架的C-1、C-4＇位磷酸化，如此构成Lipid A的亲水端﹐骨架的游离羟基和氨基可携带多种长链脂肪酸（C12，C14，C16等），这部分决定Lipid A的疏水特性。与其他分子相比，Lipid A这种规则的六边形构象使其在结构上更为稳固。革兰阴性细菌均具有基本一致的Lipid A双糖骨架，它们的主要不同在于骨架上连接的脂肪酸和（或）磷酸基团的差异。在结合的脂肪酸中﹐β-羟经基14烷酸（一种饱和14-C脂肪酸）存在于所有革兰阴性细菌LPS中，而其他脂肪酸的种类和数量因细菌种类而异。正是由于这种差别导致了不同细菌LPS毒力的较大差异﹐如缺乏一个或多个磷酸盐和（或）脂肪酸侧链的LPS毒力显著降低。KDO以α-糖苷键形式连结在非还原性氨基葡萄糖双糖（GlcNⅡ）的C-6＇位上，由于携带大量的负电荷，该键对H+的亲核攻击敏感。在酸性条件下，Lipid A很容易和核心多糖解离，而产生疏水性较强的游离Lipid A，用双蒸馏水反复洗涤后去除可溶性的多糖部分，得到纯度较高的Lipid A。如用1%的乙酸100℃ 3h降解处理LPS可获得水不溶性的 Lipid A纯品﹐即游离型Lipid A（free Lipid A），而存在于完整LPS分子中的脂质成分称为结合型Lipid A（bound Lipid A）。在溶解状态，游离型LipidA具有完整LPS的生物学活性。Lipid A结构变异将会直接影响细菌外膜的通透性和生存能力。与氨基葡萄糖双糖骨架相连的脂肪酸链是Lipid A的主要成分，肠道菌Lipid A一般含4条脂肪酸主链和两条支链，约占Lipid A分子量的70%~80%。在大部分的Lipid A中主要含十四碳的3-羟化脂肪酸，也可含有10～20碳的其他脂肪酸以及侧链脂肪酸。长链脂肪酸和磷酸盐均以酯键和酰胺键同氨基葡萄糖双糖相连。在碱性条件下，由于皂化反应使酯键和酰胺键水解断裂，因此，LPS和Lipid A在碱性条件下不稳定。

　　2023年12月22日-28日，科德角国际迎来了一场欢笑与温馨的圣诞主题团建活动。远离冬日的寒冷，远离城市的喧嚣，向着祖国的最南端出发，飞跃琼州海峡，开启了为期七天的海南环岛旅行，与自然风光和人文风情进行了一次美丽的邂逅。一、启程12月22日，在公司的组织安排下，大家在大兴国际机场乘坐飞机前往海南，全方位开启了一段令人印象深刻的旅程。当温暖的海风迎面吹拂，美丽的椰林映入眼帘，海南环岛之旅就此拉开帷幕。二、第一站丨昌江棋子湾海南环岛旅行第一站，我们来到了昌江棋子湾，打卡“海南最后一片原生态海湾”。迎着海岸线自驾一路向前，在沙鱼塘村感受独属于自己的闲暇时光。在大角公园漫步，在大中角海滩看碧海蓝天交相辉映，看水清沙幼、怪石嶙峋，一路上的风景简直太治愈啦！“ 枕海而居，听海而息”，纯粹的海岸墅居生活谁不想要呢！伴随海浪潮音，一场属于团队的DIY美味之旅正式拉开序幕。买菜、洗菜、切菜、洗餐具、做饭、掌厨、烧烤......大家分工明确，一起忙碌着，只为做出一桌可口的美食！大家齐聚一堂闲话家常，享受着独属于科德角国际员工们的美好幸福“食”光。12月24日晚上六点半，科德角国际2023年圣诞晚宴在海南棋子湾开元酒店温暖开席。七点整，让人期待的抽奖环节准时登场！幸运儿们在一片羡慕祝福中喜提奖品，温馨的晚宴也在一阵阵欢呼中圆满结束。三、第二站丨海南文昌百莱玛度假村海南环岛旅行第二站，我们奔赴海南文昌百莱玛度假村，在东郊椰林感受椰风风韵。椰海长廊长达15公里，自驾穿行在椰林当中，看参天椰树，看椰林摇曳，真的太震撼啦！四、第三站丨万宁的石梅湾海南环岛旅行第三站，我们来到了拥有“海南最美海湾”称号万宁的石梅湾，这里水天相接，海浪翻滚，尽览滨海风光，能满足你对浪漫的一切幻想！五、第四站丨海南陵水清水湾旅游区海南环岛旅行第四站，我们前往了海南陵水清水湾旅游区，这里有停满游艇的码头，点点白帆的美景一览无余，能满足你对大海的诸多想象！六、第五站丨峻灵王古庙海南环岛旅行第五站，我们走进了庄严肃穆的峻灵王古庙，这里是道教文化和海洋文化特色与信仰的最美结合。在这里，大家参拜了峻灵王，寻求心海安定，感受心灵的洗涤。在棋子湾海边，科德角国际部门之间还进行了一场别开生面的拔河比赛。无论是参与者，还是呐喊助威者，都因为这比赛而紧紧凝聚在一起。加油声、喝彩声、欢呼声此起彼伏，真实地展现了大家团结一致的精神。快乐的日子总是那么短暂！转眼间，海南环岛之旅就已经结束啦！此次团建，我们不仅感受到了海南的热带风情，也享受到了旅游的喜悦心情，更增进了团队成员之间的感情。在接下来的日子里，我们依旧会不断前进，不断充电蓄能，一起去探索更美好的远方！

　　LPS不仅是决定革兰阴性细菌感染（如脓毒症和感染性休克）的主要致病因子，而且与人类其他许多疾病关系密切，是一种危及人类健康乃至生命的最为重要的病原菌相关模式分子（pathogen-associated molecularpattern，PAMP）。目前研究最多、最为明确的LPS相关疾病是革兰阴性脓毒症或感染性休克。随着有创技术，免疫抑制剂﹑细胞毒化疗，以及广谱抗生素使用增多，脓毒症和感染性休克的发病率自20世纪50年代以来一直呈增多趋势，在美国每年因其死亡人数达17.5万～20万，儿童脓毒症病死率为10%~15%，成人则高达40%。据美国疾病控制和预防中心报道，脓毒症在美国为第12位死因。流行病学分析显示，30%~80%的脓毒症与LPS有关。由于脓毒症和感染性休克几乎都是继发于其他疾病，如创伤﹑烧伤、及免疫力低下的各种危重疾病，因此，脓毒症或感染性休克本身不应该被认为是一种独立的疾病，而只是发生于其他疾病过程中的一种并发症，因而，其治疗也应以预防或治疗原发病为主。近年来，越来越多的实验显示，LPS除引起危及生命的革兰阴性脓毒症外，也参与一些局部特定疾病的发生、发展。涉及到消化系统[如节段性回肠炎（Crohn病）溃疡性大肠炎﹑新生儿坏死性小肠结肠炎﹑急性胰腺炎、肝硬化、酒精性肝病、阻塞性黄疸、牙周疾病等]、呼吸系统（如：囊胞性纤维化、哮喘等）、心血管系统（如冠状动脉硬化）、泌尿系统（如溶血性尿毒综合征、血液透析或腹膜透析并发症）等多个系统的疾病。在这些疾病中，有的有较明确的革兰阴性致病菌，如冠状动脉疾病与幽门螺旋菌（ Helicobacter pylori）、肺炎衣原体有关，溶血性尿毒综合征与大肠杆菌O157：H7感染有关。所有病人的血中均可检测出细菌LPS和（或）抗LPS抗体。然而，内毒素与这些疾病关系的报道多是初步的，其确切作用不像脓毒症那样已形成共识，尚需要更多的研究。此外，LPS在一些自身免疫性疾病（如类风湿性关节炎）的发生，发展中也可能起一定的作用。研究认为，游离LPS可被吸收到磷脂细胞膜上，从而导致拮抗细胞表面抗原（包括磷脂）的自身免疫IgM抗体产生。在LBP、sCD14存在时，类风湿性关节炎病人的滑液成纤维细胞对LPS的敏感性明显增加，提示LPS诱导的局部炎症反应在类风湿性关节炎的发病中可能起一定作用。LPS虽为革兰阴性细菌的主要致病因子，具有很强的毒性，与人类许多疾病的发生，发展密切相关，但是也有研究显示，LPS对于维持人类健康至关重要。早在20亿年前LPS就是一种蓝绿色海藻成分，远早于人类的起源，说明它伴随着高等生物的种系发生而存在，即LPS无处不在，任何生命都无法逃脱LPS的作用，我们每个人都携带约1014个细菌，它们随着新生命的降生而逐步定居在消化道、其他黏膜表面和皮肤。因此，人体潜在性接受LPS的刺激，每个人每毫升循环血清内存在3~10pg LPS。因此，人从一出生就受到革兰阴性细菌及其产物，包括LPS的作用。LPS是哺乳动物防御系统最具活力的刺激物，它们不仅可诱导自身抗体的形成，而且也能诱导不相关抗原的抗体，激活免疫细胞，使防御感染和恶性肿瘤的能力明显增强。因此，LPS的作用对于机体重要系统，如免疫系统的生理发育是必需的，对人类更好地适应周围环境而生存是有益的。正常情况下，人的肠道内含有大量革兰阴性细菌和LPS，它们不仅对机体无害，而且对维持肠道微生态平衡.肠道屏障免疫功能、促进肠道消化，吸收功能均具有重要的生理意义。

　　LPS物理和化学结构的被阐明是内毒素研究史上的又一重大突破。内毒素制剂的分子量约为1万~100万。LPS的三个结构部分中，何者与LPS的内毒性有关？1950年，Tal和Goebel曾提出LPS内存在决定分子毒性的结构，并将其结构命名为T因子（factor T）。1954年，Westphal和Luderitz在分离，纯化脂质A的基础上提出，脂质A成分就是LPS的毒性要素，因为LPS的多糖部分携带О-抗原特异性，其结构和组成上变化很大，因此，该区域不可能具有共同的内毒性活性。脂质A存在于所有的LPS 中，其结构也高度稳定。当时，有关脂质A代表内毒性要素的观点未被广泛接受，其争论的原因有两方面：①游离脂质A，无论是高度分散，还是与白蛋白形成复合物，其最大的致热原性和毒性仅为LPS原液10%~20%；②经液体醚方法获得的高度毒性LPS制剂仅含约2%脂质。因此，Edgar Ribi认为，脂质不能作为LPS的毒性域（toxophore），并指出LPS可能利用一种独特的构象（即一种四元复合物），发挥其内毒性活性，脂质只是在构成这种复合物中发挥重要作用。ChandlerA. Stetson提出了另一个完全不同的观点，认为内毒素本身无毒性，因为抗原-抗体复合物能复制出内毒素的主要作用，如发热、致死性等，S型LPS与O-抗原抗体复合物可引起Arthus反应。因此，LPS的内毒性似乎基于其抗原性质，内毒性可能只是一种免疫现象。然而，这种观点很快被否定了。Yoon Berm Kim和Dennis W. Watson采用无免疫接触的小猪进行实验，发现小猪体内无可测定的抗体，但小猪对内毒素的致死效应高度敏感。他们认为，LPS带有内源性毒性，并被称为初级毒性（primary toxicity）。1967年后，Kasai和Nowotny，Watson和Kim等均发现，Re突变细菌株LPS缺乏多糖，仅含有Kdo和脂质A，但完全具有内毒性活性。这些结果充分证实，O特异性链和大部分核心（为LPS的多糖成分）对于内毒活性并不重要。随后的研究进一步显示，化学修饰Kdo区不影响LPS生物活性，其结果进一步强化了脂质A的作用。从疾病组织提取物、细菌过滤物到明确的分子结构，对LPS的研究经历了近200年的历史，在这个过程中凝集着许多临床学家、基础研究者和相关专业科学家的辛勤劳动和智慧。相关学科（如分子生物学、免疫学、药理学﹑血清学﹑化学和物理学）技术方法学的发展也大大推动了对内毒素的研究。尽管我们现已了解LPS的性质和结构，也能：从细胞、分子和亚分子水平阐述LPS的作用，但是仍有许多问题尚待进一步阐明，如LPS与宿主间相互作用的分子基础，LPS信号由细胞表面传递到胞核的级联反应各个环节的分子基础，LPS与外毒素的相互作用等。本书对LPS的基础与临床研究，尤其是近几十年的研究进行了系统总结、集成和组合，这对于深化认识LPS的致病作用和机制，从根本上解决 LPS相关疾病的防治问题，将具有重要的意义。

　　早期用于LPS化学结构研究的LPS主要来源于正常肠道菌群或引起胃肠道疾病的革兰阴性细菌，开始于20 世纪60年代。在LPS化学结构的研究中，Otto Luderitz起到了开拓性的作用，他率先明确提出LPS由三部分组成：即О特异性侧链（O-specific sidechain）、基础核心（basal core）和脂质A（lipid A）。O特异性侧链由几个完全相同的寡糖组成，曾被称为重复单位（repeating units）BOB。细菌间О特异链的结构有着明显差异，其抗血清对相应细菌有很强的特异性，一般不与其他细菌反应。基于这种认识，Fritz Kauffmann建立了鉴定沙门菌血清型（serotypes）的方法。根据该方法，可将细菌分为不同的血清分型。О特异性链的差异也使相应的LPS具有独特的特性，Kauffmann、Luderritz和Westphal将此特性称为LPS的化学表型（chemotypes）。1975年，Stead发现，一些革兰阴性细菌无О特异链。这些细菌的血清特异性是由LPS糖基化区的末端糖决定的。因为这些细菌LPS具有相对短的糖基链，Schneider（1984）将这种LPS称为脂寡糖（lipooligo-saccharide，LOS）。核心寡糖（core oligosaccharide）是 LPS的另一个结构部分。1967年，Luderitz和westphal等首次提出了核心结构，认为核心由靠近О链的外核和靠Lipid A的内核组成。用于核心寡糖的结构特征研究的最好的实验对象是肠道杆菌的Rough突变株。Rough突变株表现为不规则和粗糙的菌落形态，具有独特的血清学特征（与О抗原抗血清无反应）。其LPS为R型LPS，所有R型LPS均缺乏О特异链。1969年，West-phal和Luderitz进一步建立了提取R型LPS的方法，即酚-氯仿-石油（phenol-chloro-form-petroleum）法。虽然，脂质A（Lipid A）早就被认为是LPS的毒性中心，但是，该观点在很长时间内并未被广泛接受。对其结构的认识较为困难，因而明显晚于对О链和核心部分的认识。Miles和Pirie可能是最先认识到脂质成分的科学家。早在1939年，他们利用矿物酸处理马耳他布鲁杆菌LPS时，发现了一种类似脂质的沉淀物。当时，Miles和Pirie并没有将这种物质称为LPS，而被称为天然抗原（native antigen）。最早提出脂质A名称的是Westphal和Luderitz。1954年，科学家利用矿物酸处理未降解的多糖，获得了一种不溶于二和石油醚，但易溶于氯仿和吡啶的物质，为了区分另一种甲酰胺提取的脂质成分，前者被称为脂质A，后者被称为脂质B。脂质B后来被证明是磷脂酰乙醇胺。后来的研究证实，用酸处理LPS可使2-酮-3脱氧辛酸（Kdo）与脂质A间连接发生断裂，产生脂质A沉淀物。1958年，美国Carl Niemann在研究大肠杆菌LPS时提出了脂质A的化学结构： D-G1CN，磷，和（R）-3-羟十四烷酸。Westphal和Luderitz也发现沙门菌脂质A含有同样成分。1969年，Jobst Gmeiner分析Sminnesota Re突变株LPS，首次显示脂质A含有一个D-G1CN二糖，二者β（1~6）互联，在1和4位点上携带磷残基。随后在肠道杆菌和非肠道杆菌的LPS的脂质A均发现了同样的结构。1983年，阐明了大肠杆菌脂质A完整的共价结构，分子量为1798。1990年，Chris RH Raetz通过生物合成脂质A进一步证实了脂质A的结构。

　　内毒素的发现主要应归功于对霍乱弧菌（vibrio cholera）的研究。在19世纪后期，经常发生霍乱流行，尤其是1892年前后，在全世界一些大的海港城市发生了大规模霍乱流行，成千上万的人因此而死亡。因此，当时霍乱研究备受关注。1884年，Robert Koch证明霍乱弧菌为霍乱的致病菌，并在他的实验室里系统地开展了霍乱弧菌的致病性研究。当时在该实验室工作的Richard Pfeiffer（1858~1945）研究发现，霍乱弧菌除释放不耐热的外毒素到培养基外，并观察到霍乱弧菌能产生第2种完全不同的毒素，这种毒素可牢固结合在细菌细胞上，具有很强的毒性作用，在细菌溶解时才被释放出来。由于这种毒素与已发现的其他毒素明显不同，Pfeiffer称其为内毒素（endotoxin）。之后“内毒素”一词被文献广泛引用。几乎同时，意大利人Eugenio Centanni（1863~1948）利用乙醇及其他分离过程，从大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌等自溶物中分离出---种无菌白色粉末的高致热原性物质。该物质对热十分稳定，不属于蛋白质，且与细菌的生存和细菌感染引起的病理变化密切相关，被他称为Pyrotoxina。应该说，Centanni已获得较高纯度的内毒素，是第一个认识细菌致热原与内毒素间密切关系的人。Edmundweil（1879~1922）和ArthurFelix（1887~1956）在变形杆菌的研究中发现，细菌培养物呈两种生长形式：即聚集（swarming）生长和不聚集（nonswarming）生长。他们将聚集生长的细菌称为Hauch（德语），不聚集生长的细菌称为Ohne hauch。并从中分离出两种不同的物质，被他们分别称为H-抗原和O抗原。其中，O-杭原耐热。实际上，O抗原就是内毒素。此外，A Joos将从鼠伤寒菌分离得到的热稳定物质称为β-agglutinogens。Pfeiffer的内毒素、Centanni的pyrotoxina和其他学者分离出的细菌过滤物均为含有多种细菌产物的混合物。经历了数十年后，法国微生物学家Andre Boivin（1895~一1949）与罗马尼亚科学家Lydia Mesrobeanu（1908~1978）一道在1932年发明了一种至今仍被广泛采用的从革兰阴性细菌提取内毒素的方法：即三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）法。该方法分离得到的产物主要为多糖和脂质，仅含少量蛋白，被他们称为antigenes glycido-lipidiques（法语）。Pennel和Huddeleson利用TCA法从布鲁杆菌中也获得了细菌毒素，被他们称为内抗原（endoantigen）。Walter T.J.Morgan和Walter F.Goebel利用有机溶剂和水进一步改进TCA提取方法，从而使获得的产物更为均一。随后的研究中，许多学者都采用Morgan的提取物。20世纪40年代初期，美国Bradley Coley医师利用灭活的Bacillus prodigiousus和链球菌的高致热原性混合物治疗恶性肿瘤病人，取得明显疗效。Murray Shear试图从Coley疫苗的活性成分Bacillus prodigiousus中分离出致肿瘤坏死的物质。结果显示，分离物主要为多糖和脂质成分，含有少量蛋白，被Shear等命名为脂多糖（lipopolysaccharide）。20世纪40年代后期，otto Westphal和Otto Luderitz系统地分析了Walter Morgan从沙门菌、大肠杆菌和其他肠道杆菌的分离物，进一步发现分离物的致热活性主要集中在O-抗原复合物中，且未降解多糖呈高致热原性，结合蛋白的多糖活性较低，降解多糖和单纯蛋白质则完全无活性。1952年，Westphal建立了一种新的更有效的分离方法，即热-酚-水抽提法（hot-phenol-water extraction method），其分离物几乎不含蛋白，仅含糖、磷和脂肪酸成分，具有非常强的生物活性，静脉内注射1ng/kg，就可致人发热，被Westphal和Luderitz称为脂多糖。该方法的建立被认为是内毒素研究史上的里程碑，并成为经典的分离方法而被广泛应用。显然，早在20世纪初期，人们已从不同的革兰阴性细菌中分离出不同形式或不同纯度的内毒素物质，不同的实验室对其有不同的命名。随着内毒素分离方法不断改进和提高，以及相关学科，如化学、生物学、血清学的发展，20世纪50年代后，人们逐步认识到这些从革兰阴性细菌分离得到的物质实际上为同一种成分，并且是所有革兰阴性细菌细胞壁外膜上的主要结构成分，对细菌生长和活力至关重要，是革兰阴性细菌的主要致病因子，并将这些物质统称为内毒素或脂多糖（LPS）。从此，内毒素的研究日益受到微生物学家，临床医师、生物学家和免疫学家的普遍重视。1952年和1958年分别在美国纽约和德国弗赖堡召开了第一、二届内毒素国际会议。1988年，在美国得克萨斯大学微生物学教授L.Joe Berry的倡导和努力下，成立了国际内毒素学会（International Endotoxin Society，IES），第一届学会主席为宾夕法尼亚大学免疫学教授Alois Nowotny。目前会员已遍布六大洲，39个国家，400多名会员。1994年，创办了《内毒素研究杂志》（Journal of Endotoxin Research），得克萨斯大学医学中心的David C.Morrison教授为第一任主编。

　　细菌内毒素的研究已有200多年历史，最早的相关研究起始于对腐烂动物的观察。18世纪Albrecht von Haller（1708~1777）将从腐烂鱼或肉中提取的腐烂液体经静脉注射到动物体内，发现能引起动物发热和其他疾病症状，而新鲜鱼或肉的提取物不引起发热反应。当时认为，食物在降解和腐烂过程中产生了能致热和致病的毒性物质。早在19世纪，人们就试图鉴别这种腐烂毒素，Ernst von Bergmann（1836~1906）将这种毒素命名为Sepsin。应该说，Dane Peter L.Panum是第一位系统地、科学地研究这种毒素的科学家。在1874年，他发表论文明确指出：①这种腐烂毒素是不挥发的，不是一种简单的腐烂或发酵组织的终末产物，也不是活的微生物，这种毒素可能来源微生物；②毒素耐热，不是一种酶；③可溶于水，不溶于纯乙醇；④腐烂液体内的蛋白样物质本身无毒性，但能将毒素吸收到表面，毒性成分至少能部分从沉淀物中洗脱；⑤注射12mg浓缩物就足够引起高热，致犬死亡。根据我们现在对内毒素的认识，实际上，Panum的研究结果已经涉及到内毒素。因此，可以说，他是最早描述内毒素特性的研究者。由于这种毒素最主要的表现是引起发热，在19世纪，大多数人将其称为致热物质（pyrogenic material）或致热原（pyrogen）。首次提出“致热物质”的是Theodor Billroth（一位外科教授），他在1862年发表的论文中描述道：致热物质不仅存在于腐烂液体和新鲜脓液内，也存在于干的腐烂物和干的脓液内。Sir John Burdon-Sanderson（1828~1905，英国生理和病理学家）在1896年进一步将“致热物质”称为“致热原”，并在Panum和von Beugmann研究的基础上，Burdon-Sanderson至少获得了部分纯化的致热原，首次提出了致热物质的来源问题：即内源性（致热原存在于血液或组织液内）和外源性（来自微生物）两方面。19世纪末20世纪初，人们才明确认识到，感染是由微生物所致。在这以前，地方性或流行性发生的疾病，如瘟疫和霍乱被认为是毒气（miasma）所致，认为这种毒气来源于土壤或土壤下的一种不可见的挥发性物质，被称为“坏气（badair）”，这就是“瘴气（malaria）”一词的起源。因此，当时认为，这种感染的传播不是从人传到人，而是通过环境因素，如毒气。另一方面，医生们很清楚地观察到一些疾病，如梅毒，是从人传到人，而不是通过坏的空气。因此，早期认为感染的发生有两个途径：即毒气和接触传染（contagion）。Louis Pasteur（1822~1895）首次明确证实，感染性疾病是由微生物引起的。他认为这些微生物存在于空气的尘埃中，可到处传递，侵入到伤口内，并在伤口繁殖，引起感染。Billroth虽认为感染是由细菌引起的，但认为细菌本身存在于宿主健康组织内，在受到炎症刺激时，细菌被激活而繁殖，即提出“内源性腐败理论”。德国细菌学家Edwin Klebs（肠道细菌Klebsiella就是以他的名字命名的）认为，引起感染的细菌来源于外界、细菌可以侵入到健康而又受到刺激的组织内，并在感染发生过程中产生致热物质。丹麦医生Hans-Christian Gram（1853~1939）于1884年发明了一种至今仍被广泛采用的染色技术，即革兰染色法（Gramstain）。利用该方法可将所有细菌分为两类：革兰阳性菌（Gram-positive bacteria）和革兰阴性菌（Gram-negative bacteria）。随着感染由微生物所致的认识日益明确，致热原来源的研究也由腐烂组织转移到微生物。Gustave Roussy（1874~1948）首次从细菌中分离到两种物质：一种引起低热，称为frigorigenine.另一种引起高热，称为pyretogenine。他认为这些物质位于细菌内，受到酶的溶解作用后被释放出来。Ludwig Brieger随后发现，伤寒杆菌也能产生一种毒性物质，即伤寒毒素（typhotoxin）。“毒素（toxin）”一词正是Brieger首次提出的。随后，人们在其他杆菌的培养物中都分离出一种高分子量蛋白样毒性物质，为无菌白色粉末，被称为toxalbumin。进一步研究发现，许多致病细菌都产生毒性物质，这些毒性物质能引起致死性反应。由于当时分离的毒素都显示蛋白样特性，曾一度认为所有的细菌毒素都是蛋白质。 来源：《细菌内毒素的基础与临床》，作者：蒋建新，如有侵权，请联系删除，谢谢！

　　肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是具有广泛生物学活性的多肽介质，因它最早是在形容自发性肿瘤消退现象时而被命名的。TNF-α一方面参与机体的免疫防御机能，作用于外来致病因子，杀灭外来入侵者。另一方面参与介导休克、炎症反应、组织损伤及多器官功能衰竭等病理过程。近年来的研究表明，内源性TNF-α能介导内毒素的许多生物学作用及病理生理过程，在内毒素所致肝损害过程中起重要的促炎介质作用。TNF-α为相对分子质量为17000的多肽。人TNF-α由157个氨基酸残基组成，不含糖基，而鼠TNF-α为156个氨基酸残基，含有唾液酸或氨基半乳糖。人与鼠TNF-α的氨基酸顺序有79%的同源性，人TNF-α的基因是位于第6对染色体的主要组织相容性复合体。TNF-α具有疏水性，等电点为4.7～~5.3，对某些蛋白质敏感，其活性形式为相对分子质量为55000的三聚体。巨噬细胞及单核细胞是产生TNF-α的主要细胞，其他细胞如淋巴细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞及中性粒细胞等受刺激后也可合成释放少量TNF-α。肝内的巨噬细胞为体内最大的固定巨噬细胞池，是产生TNF-α的最主要部位。内毒素刺激肝内的巨噬细胞后，可产生大量的TNF-a，γ-干扰素可增加内毒素诱导的TNF-α释放，其他细胞因子对巨噬细胞也有正反馈作用，使其产生更多的TNF-α。因此一旦TNF-α产生，就有放大作用。前列腺素E2和则抑制TNF-α的产生，而TNF-α又可诱导肝巨噬细胞合成释放前列腺素E2而形成反馈抑制，这对TNF-α的合成具有重要的调控作用。内毒素是TNF-α产生最强力的诱导剂，内毒素作用于巨噬细胞CD14受体上，再经Toll样受体家族，使细胞内TNF-α基因转录迅速增加，致使TNF-α的mRNA含量及TNF-α的释放显著增加。给人或哺乳动物注入小剂量内毒素约30min后血中都可测出TNF-α，在1~2h内，其TNF-α水平达到峰值，此后开始下降，实验5h后降至基线水平。作者对慢性肝病患者血清内毒素及TNF-α水平检测的结果表明，内毒素水平与TNF-α水平呈正相关，用乳果糖治疗后，内毒素水平下降，TNF-α浓度也随之下降，说明肝病患者TNF-α的产生与内毒素血症有关，也就是说，肝病患者体内细胞因子的变化是由于内毒素血症所致的。TNF-α的半衰期约为5~10min，体内示踪实验表明TNF-α主要分布于肝脏，其次为皮肤、胃肠道和肾，提示肝脏富含TNF-α受体。TNF-α可通过内分泌、旁分泌和自分泌发挥生物学作用，但TNF-α介导的组织病理生理效应可能主要取决于特定组织的旁分泌和自分泌作用。

　　生物制药生产商对内毒素有两个担忧。首先，注射成品中的内毒素含量必须低于内毒素限值。这一问题适用于所有注射药物、生物制品和无热原医疗器械。这方面的文献记载很多，本文不再讨论。第二个问题是内毒素对用于生产生物制药的表达系统和产品本身的影响。内毒素对不同细胞类型或细胞系的影响差别很大。我们应该了解内毒素对相关细胞的影响，以便采取适当的控制措施。即使是母细胞系和子细胞系，对内毒素的敏感性也可能大相径庭。1对所用的细胞表面受体的认识可以提醒研究者注意潜在的内毒素敏感性。人体细胞上的CD14受体与内毒素敏感性密切相关。2当培养基中含有血清时，这一点尤为重要。血清成分，如脂多糖结合蛋白（LBP）和septin复合物，可增强CD14细胞对内毒素的激活作用。3,4相反，一些哺乳动物和脊椎动物的细胞系统对内毒素具有耐受性。细菌和酵母培养基中内毒素的存在通常不是一个问题。下文将举例说明内毒素对生物系统的影响。在涉及细胞培养的研究中，必须防止因生物对污染物的反应而产生的虚假结果。此外，还必须将产物的特性与污染物内毒素的特性区分开来，细胞因子尤其如此。一、膜和形态学效应内毒素是革兰氏阴性菌的两亲性膜成分。它可能会干扰其他细胞的膜结构和功能，这并不奇怪。内毒素通过磷酸基团与阳离子蛋白质发生反应，其脂肪酸链则与脂质膜和蛋白质的亲水区发生作用。内毒素与细胞膜的相互作用可能表现为明显的形态学变化，如中国仓鼠卵巢细胞膜紊乱、5表面褶皱和细胞器增多、6细胞质中出现大液泡、7形态学损伤和己糖摄取减少、8和严重的膜损伤。9有时形态变化暴露于清洁介质后是可逆的。10此外，不同的内毒素对形态学的影响也不同。11情况严重的话，内毒素对细胞膜结构和功能的影响可能具有细胞毒性。不同内毒素12和不同细胞系之间的毒性程度各不相同。13然而，至少有一些细胞可能诱导对内毒素的耐受性。14二、分泌/生产细胞膜对细胞产物的合成至关重要，内毒素会影响这一合成过程。这显然是细胞研究和商业细胞系开发的关键问题。细胞的敏感性是多种多样的；例如，从内毒素反应亲本中克隆了两种无反应的T细胞系。15此外，内毒素的反应可能会受到其他因素的影响，如温度。16内毒素对体外单细胞产生细胞因子的影响已被广泛报道。内毒素被认为是肿瘤坏死因子（TNF）产生的最有效刺激物。17已经注意到对转录的影响，18,19,20,21并且已经提出刺激的主要调节可能发生在这个水平上。22除细胞因子外，一系列细胞产物也受到内毒素的影响。哺乳动物细胞合成受到刺激或增强的产物包括前列腺素、23酸性磷酸酶、6纤维蛋白溶解抑制剂、24胶原酶生成、25神经生长因子、26B因子分泌、27多肽、28血小板激活因子、29粘附抑制剂、30粘附分子-131和促凝剂（剂量依赖性）。已观察到内毒素对血管紧张素转换酶活性33、蛋白多糖23和α2 巨球蛋白34的合成有抑制作用。这些反应可能与剂量有关，在某些情况下，不同的内毒素会产生不同的反应。例如，在某些剂量下，乳杆菌内毒素会刺激磷酸酶的产。